论著脂蛋白a基因单核苷酸多态性变
本文刊于：岭南心血管病杂志，，26（03）：--
作者：李志根1，刘丰1，陈竹君2，杨峻青2，罗德谋2，孙硕2，周颖玲2
单位：1.华南医院老年心内医院；2.广东省心血管病研究所医院（广东省医学科学院）摘要目的
探讨脂蛋白（lipoprotein,Lp）(a)基因单核苷酸多态性（SNP）变异与冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）严重程度的相关性。
方法
入选冠状动脉（冠脉）造影证实的冠心病患者例，采用TaqMan法对Lp(a)基因SNPrs、rs进行基因分型；采用Gensini评分计算患者的冠脉病变的严重程度。比较携带不同基因型患者的血脂浓度和患者的Gensini评分。
结果
与Lp(a)正常组患者相比，Lp(a)升高组患者的rs的变异单体频率（单体T）显著升高(15.4%vs.8.3%,P0.)，但两组患者的rs变异单体频率没有显著差异（P=0.）。与含有rs野生型基因（CC）的患者相比较，变异基因（CT/TT）患者的Lp(a)浓度明显升高[41.3(20.8,74.6)vs.18.6(10.3,40.9),P0.]，但两组患者的总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度并没有明显差异（P均0.05）；然而，rs的两个基因型分组之间的Lp(a)和其他血脂成份浓度均没有显著差异（P均0.05）；与携带rs野生型基因的患者相比较，携带rs变异基因患者的冠脉Gensini评分显著升高（46.0±16.5vs.42.2±15.6,P=0.）；然而，rs的两个基因型患者的冠脉的Gensini评分没有显著差异（P=0.）。
结论
rs变异与冠心病患者的Lp(a)浓度相关，并且rs变异可能与冠心病患者的冠脉严重程度相关。
脂蛋白(a)[lipoprotein(a),Lp(a)]是非高密度脂蛋白（high-densitylipoprotein,HDL-C）的一员，其结构与低密度脂蛋白（low-densitylipoprotein,LDL-C）相似。由于Lp(a)富含胆固醇，颗粒小，具有强致动脉粥样硬化作用。研究表明，Lp(a)浓度主要由位于染色体6q27上编码Apo(a)的基因(LPA)决定[1]。我们前期的研究表明，LPA单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)rs变异与中国汉族人群冠状动脉（冠脉）粥样硬化性心脏病（冠心病）患者的Lp(a)浓度呈明显相关[2]，但这种基因变异是否与冠心病严重程度相关目前尚不清楚。本研究将进一步研究LPASNP变异与冠心病严重程度的相关性。
1资料和方法
1.1一般资料
研究对象顺序入选从年5月至年8医院心内科住院治疗的冠心病患者共例。入选标准：（1）汉族人群，性别不限，年龄大于18岁，小于80岁；（2）经冠脉造影确诊为CAD，存在一支或以上冠脉主干或主要分支狭窄程度超过50%。排除标准：（1）合并严重感染、甲状腺疾病、免疫系统疾病或其他可能影响Lp(a)浓度的疾病；（2）正在服用或既往半年内连续服用烟酸、甲状腺素、雄激素、雌二醇及其替代物等可能影响Lp(a)浓度的药物；（3）近3个月内连续服用他汀药物超过2周。所有患者均自愿参加研究并签署知情同意书。医院伦理委员会同意该研究进行。
1.2方法
1.2.1冠脉造影和冠脉严重程度评估所有患者入院1～3d内均完成冠脉造影，每支血管均进行≥3个体位投照，由两位经验丰富的冠脉介入医师独立采用直径法对血管的狭窄程度进行判定，结果不一致时取两者的平均值作为最终结果。根据4支血管(左主干、左前降支、左回旋支、右冠)中病变血管的不同节段及狭窄程度制定不同的权重系数，最后相加得到Gensini评分。
1.2.2LPASNP基因检测采用TaqMan法对rs、rs进行基因分型。利用核酸外切酶对5’特异等位基因染色标记的切除产生持续的检验信号，反应体系包括：以基因组DNA或聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)产物为模板；一对PCR引物，以及分别用FAM和VIC标记的2条MGB探针检测SNP的两种类型。在PCR反应终点读取分型数据。将6-FAM探针设定为单体型1（野生型），VIC探针设定为单体型2（变异型）。如检测结果只检测到单体型1，则基因型为野生纯合子；如检测结果只检测到单体型2，则基因型为变异纯合子；如同时检测到单体型1和单体型2，则基因型为野生/变异杂合子。
1.2.3一般临床资料及各项指标的测定检测前记录所有患者的临床基线资料，包括性别、年龄、是否原发性高血压（高血压）、糖尿病、吸烟等情况，并测量身高、体质量、腹围，计算患者的体质量指数（BMI）。抽取10～12h空腹静脉血以测定血糖及血脂质和肾功能指标，包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、LDL-C、HDL-C、Lp(a)、空腹血糖(GLU)、糖化血红蛋白（HAc1）和肌酐（CREA）和高敏C-反应蛋白（hs-CRP）。
1.3统计学分析
计数资料采用[n(%)]表示；符合正态分布的计量资料用(均数±标准差)表示，不符合正态分布的连续变量采用[M（P25~P75）]表示。两组间符合正态分布的连续性变量比较采用t检验，不符合正态分布的连续性变量比较采用Mann-whitneyU非参数检验。如最小基因型频率5%，将其与中间基因型合并后再进行统计。以P＜0.05为有统计学意义，采用SPSS17.0统计软件进行数据处理。
2结果
2.1患者的基线特征
本研究共入选冠心病患者例，其中男性占82.4%，平均年龄63.4岁，其中23.6%的患者合并糖尿病，58.6%的患者合并高血压，37.5%的患者有吸烟史（见表1）。其中入院诊断为稳定型心绞痛（SA）的患者例（25.0%），不稳定型心绞痛（UA）患者33例（37.3%），急性心肌梗死（MI）患者例（37.7%）。冠脉造影示24.8%的患者为单支病变，31.3%的患者为两支病变，43.9%的患者为三支病变（见表2）。
2.2患者LPA单核苷酸多态性基因型分布和单体频率比较
患者的基因型分布和单体频率见表3。Rs和rs变异在中国汉族冠心病患者较常见，其变异单体频率分别为10.1%（单体T）和8.1%（单体G）。将患者按Lp(a)浓度分为Lp(a)正常组[Lp(a)30mg/dL]]和Lp(a)浓度升高组[Lp(a)≥30mg/dL]。与Lp(a)浓度正常组患者相比，Lp(a)浓度升高组患者的rs的变异单体频率（单体T）显著升高(15.4%vs.8.3%,P0.)，但两组患者的rs变异单体频率没有显著异差（P=0.）。
2.3各单核苷酸多态性基因型患者血脂浓度比较
患者各SNP按野生型基因和变异型基因分组，并比较各SNP两组患者之间的血脂浓度。结果表明，与含有Rs野生型基因（CC）的患者相比较，存在基因变异的基因（CT/TT）患者的Lp(a)浓度明显升高[41.3(20.8,74.6)vs.18.6(10.3,40.9),P0.]，但两组患者的TC、TG、LDL-C和HDL-C浓度并没有明显差异（P均0.05）；然而，Rs的两个基因型分组之间的Lp(a)和其它血脂成份浓度均没有显著差异（P均0.05）（见表4）。
2.4各单核苷酸多态性基因型患者冠脉病变严重程度比较
将患者各SNP按野生型基因和变异型基因分组，并比较各SNP两组患者之间的冠脉病变支数和Gensini评分。结果表明，尽管Rs两个基因型患者的血管病变构成比没有显著差异，但以Gensini评分对患者的冠脉病变严重程度进行量化后，与携带野生型基因的患者相比较，携带变异单体患者的冠脉Gensini评分显著升高（46.0±16.5vs.42.2±15.6,P=0.）；然而，Rs的两个基因型分组之间的无论是血管病变支数还是患者冠脉的Gensini评分均没有显著差异（P均0.05）（见表5）。
3讨论
血浆Lp(a)浓度受年龄、性别和环境因素的影响较小，主要由位于染色体6q27上编码Apo(a)的基因(LPA)决定[1]。近年来使用基因芯片技术可以高通量快速扫描与某个疾病相关的SNP。Clarke等[3]用基因芯片对冠心病患者及正常对照者个候选基因上个SNP进行了分析，发现位于6q26-27区域编码Apo(a)的基因变异(rs和rs)与冠心病风险关联最强，并且这两个位点变异与高加索人血浆Lp(a)浓度和LPAK4-2重复数目明显相关。rs变异可解释8%的Lp(a)浓度的变异，rs变异可解释25%的Lp(a)浓度的变异，联合分析表明，这2个SNP位点变异对血浆Lp(a)浓度的影响的权重可占到36%。然而，LPA变异在各个人群中存在差异，主要表现为同一位点变异在某个人群中较常见，在另一个人群中少见或根本不存在变异；我们之前的研究表明，rs变异在汉族冠心病患者罕见[2]。尽管rs变异在汉族冠心病患者较常见，其变异频率甚至比高家索人群更高(8.1%vs.1.4%)，但我们的研究表明其变异却与本研究患者的血浆Lp(a)浓度并未见明显的相关，因此，也没有发现其变异与患者冠脉严重程度的相关性。其原因未明，变异单体频率差异和LPAK4-2重复数目变异相关的apo(a)形状的异质性有可能部分解释同一基因变异对两个人群Lp(a)浓度不同的影响[4-5]。
研究表明，编码Apo(a)的基因和编码纤溶酶原的基因结构相似，它们都含有链内二硫键稳定的环状结构[被称为kringle结构域，K结构域]。纤溶酶原基因含有5种编码不同K结构域的编码系列(K1-K5)，其中的两种编码系列也出现在Apo(a)基因，它们分别编码K4和K5结构域。Apo(a)基因共有10种不同的K4编码系列，包括K4-1型至K4-10型，其中K4-1型和K4-3至K4-10型呈单倍拷贝，而K4-2型呈多倍拷贝，拷贝数从3倍至大于40倍不等，其相应的表达产物Apo(a)呈现大小不同的亚型，包含12-50个K4结构域，分子量-KDa不等，具有很大的异质性[4,6]。一般来说，Apo(a)基因含有的K4-2型编码系列重复越少，其编码的Apo(a)蛋白的分子量越小，则血清Lp(a)浓度越高[7-9]，其致动脉粥样硬化的能力可能更强[10]，并且这种含有小Apo(a)的Lp(a)对他汀治疗无反应甚至进一步升高[11]。因此，我们推测，尽管中国汉族冠心病患者rs也出现了变异，但其变异基因含有的K4-2型编码系列重复可能与高加索人存在差差异，更大可能是汉族冠心病患者rs变异基因含有的K4-2型编码系列重复更多，因此表达出的Lp(a)浓度并没有升高，但其具体机制须实验室研究进一步证实。
本研究表明，rs变异在中国汉族冠心病患者比较常见，其变异单体频率为10.1%，其结果与SHARE队列中国人群的研究结果相一致。我们的研究发现，rs变异与中国汉族冠心者患者的Lp(a)浓度明显相关，与携带野生型基因的患者相比较，携带变异基因患者的Lp(a)浓度明显升高（P0.05）。进一步的分析表明，携带变异基因患者的冠脉病变更严重，表明为Gensini评分更高（P=0.）。本研究提示，rs变异首先引起患者的Lp(a)浓度升高，而升高的Lp(a)浓度具有致明显的动脉粥样硬化作用，研究表明，Lp(a)浓度升高与冠心病的独立危险因素并且与冠心病的不良预好的独立预测因子[12-14]。升高的Lp(a)浓度有可能通过以下几个机制促进动脉粥样硬化的发生、发展：（1）Lp(a)可以在动脉粥样斑块聚集、与ApoB结合并且被泡沫细胞摄取[15-16]；（2）Apo(a)通过促进内皮细胞粘附因子产生、泡沫细胞形成、平滑肌细胞迁移等作用，在动脉粥样硬化发展过程中起重要作用[17]。Lp(a)的致动脉粥样硬化作用不仅与它的浓度相关，并且与Apo(a)独特的结构和形状相关，后者具有明显的多态性。这就决定了不同人群除了Lp(a)浓度不同外，它的致动脉粥样硬化能力也可能存在差异。例如，虽然黑人的Lp(a)浓度较其他人群明显升高，但并没有发现Lp(a)浓度升高是黑人冠心病的危险因素[18-20]，其原因可能与黑人的Lp(a)的Apo(a)结构与高加索人不一样有关，这点在临床研究中得到证实。Paultre等[10]检测了例经冠脉造影证明的CAD患者(包括白种人和非裔美国人)的Lp(a)浓度和Apo(a)亚型，研究Lp(a)浓度、Apo(a)亚型和两者结合分别与冠心病风险的关系。结果表明，Lp(a)浓度升高见于26%白种人和68%非裔美国人。在Lp(a)浓度升高的人群中，80%的白种人含有小分子Apo(a)亚型，但只有26%的非裔美国人含有小分子Apo(a)亚型。在所有患者中，只在含有小分子Apo(a)的白人男性和黑人男性中观察到Lp(a)浓度升高与冠心病风险明显相关（P0.01），并且这种相关在校正了年龄、吸烟、糖尿病、高血压以及HDL-C、LDL-C和TG浓度后仍然显著，提示含有小Apo(a)亚型的Lp(a)的致动脉粥样硬化作用更强；但这种现象在女性人群中并不显著[21-22]，提示Lp(a)作为冠心病的危险因素存在种族和性别差异。因此，从基因水平和相应的分子水平研究有助于阐明Lp(a)在不同人群的致动脉粥样硬化作用。
本研究的结果表明，rs变异首先引起个体的血清Lp(a)浓度升高，并且这些个体的Lp(a)可能是含有小Apo(a)亚型的Lp(a)，因此具有更强的致动脉粥样硬化作用，因此，患者的冠脉病变程度更重，但其具体机制须进一步研究证实。本研究具有一定的局限性：本研究未纳入正常人群作为对照组，不清楚冠心病和健康人群之间相关SNP基因频率是否存在差异，因此未能计算rs单体变异的相关冠心病风险。
总之，本研究结果表明，LPASNPrs和rs位点变异在中国汉族人群冠心病患者中较常见。在研究的SNPs中，只有rs变异与患者的Lp(a)浓度相关。并且进一步的研究表明，rs变异可能与冠心病患者的冠脉严重程度相关。
参考文献（略）
敬请
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